Molecular Defects in Human Diseases, Docent: J. Brouwer

Fragile X Syndrome (FXS) is een veelvoorkomende oorzaak van mentale beperkingen en een van de belangrijkste onderliggende oorzaken van autisme. Verder gaat de ziekte vaak gepaard met ADHD en FXTAS. Overerving van de ziekte is X-linked en komt voor bij 1 op de 4000 mannen en 1 op de 6000 vrouwen. Enkele van de meest voorkomende symptomen zijn:

 Mentale retardatie;

 Macro-orchidism (grote testes);

 Lang gezicht;

 Grote, uitstekende oren;

 Platvoeten;

 Terugkerende oorontsteking;

 Toenemende achterstand motorische ontwikkeling;

 Impusliviteit/oncontroleerbaarheid.

Voor de connective-tissue afwijkingen (testes, gezichtsvorm, etc.) is nog geen verklaring gevonden. Genetische achtergrond

Net als Huntington’s Disease is FXS een ziekte die veroorzaakt wordt door een instabiele trinucleotide repeat (TNR) in het DNA. Bij FXS-patiënten heeft een mutatie plaatsgevonden in de CGG-repeat voor het FMR1-gen op het X-chromosoom. Hierdoor is een insnoering zichtbaar op de lange arm van dit chromosoom. Gezonde mensen hebben maximaal 55 CGG-repeats, terwijl dit aantal bij FXSpatiënten boven de 200 ligt (figuur 1). Personen die tussen de 55 en 200 repeats hebben, hebben een premutatie. Deze personen hebben zelf geen FXS-symptomen, maar zijn wel drager van de ziekte. Het gen komt hoog tot expressie in het brein en de testes en een aantal splice-varianten van het mRNA kunnen symptomen veroorzaken die sterk lijken op FXS.

Figuur 1: Schematische weergave van het totale FMR1-gen. NLS = nuclear localization signal, KH1 = K Homology 1 domein (RNA-binding), KH2 - K Homology 2 domein (RNA-binding), NES = nuclear export signal en RGG = RNA-binding domein. De driehoek (links) geeft de plaats van de CGG-repeat-verlenging weer (groen = gezond, blauw = premutatie, rood = mutatie).

De GCC-repeat bevindt zich in de 5’ untranslated region (UTR) van het FMR1-gen (figuur 1). Het coderende gedeelte van gen blijft dus in theorie zelf intact bij FXS-patiënten. Bij personen met de volledige mutatie (> 200 repeats), worden alle CpG’s in de CGG-repeat en de FMR1-promoter gemethyleerd (figuur 2a, het mechanisme is niet bekend). Normaal komt het DNA van de repeat en de promter voor in een open toestand, zodat RNA polymerase kan binden. Methylatie van de CpG’s is echter een signaal voor eiwitten dat dit gedeelte van het DNA verpakt moet worden in heterochromatine (‘The Cell’, pagina 467-471), waardoor volledige silencing van het FMR1-gen optreedt (figuur 2b). FXS wordt dus niet veroorzaakt door een mutatie in het FMR1-genproduct, maar door totale afwezigheid van dit eiwit. Toediening van moleculen zoals A-azadC en PBA, kan dit heterochromatine weer openen, waardoor expressie van het FMR1 weer mogelijk wordt (figuur 2c). Dit heft echter ook silencing op van alle andere in heterochromatine gepakte genen, waardoor zeer veel andere complicaties (en zelfs overlijden van de patiënt) op kunnen treden. De methylatie van deze CpG’s wordt doorgegeven aan nakomelingen via maintenance methylases (epigenetica).

Behalve methylatie van GpG’s, draagt ook deacetylatie van de lysines in de histonstaarten van de nucleosomen bij aan de pakking van DNA in heterochromatine (histon code). Deacetylering van lysines brengt een positieve lading terug in de histonstaarten, waardoor de afstoting tussen nucleosomen verandert, wat de silencing van het FMR1-gen stimuleert.

Molecular Defects in Human Diseases, Docent: J. Brouwer

Naast RNA-bindende domeinen heeft FMRP ook een NLS (‘nuclear localisation signal’) en een NES (’nuclear export signal’) (figuur 1). Het kan dus de kern ingaan om daar mRNA’s te binden om ze vervolgens uit de kern te transporteren: het is dus een mRNA cargo protein. Het FMRP brengt de mRNA’s vervolgens naar de uiteinden van de dendrieten via het netwerk van microtubuli (figuur 5, microtubuli bepalen de vorm van neuronen: functie bepaalt de structuur en niet andersom). Behalve zijn RNA-bindende functie heeft FMRP ook een translatie-repressie functie. De mRNAmoleculen worden niet getransleerd zolang ze aan het FMRP gebonden zijn. Het FMRP brengt het mRNA dus naar een plaats waar het niet afgeschreven wordt. De reden dat dit gebeurt is om een snelle respons te kunnen creëren bij stimulatie van de uiteinden van de dendrieten. Wanneer de dendriet een signaal ontvangt van een axon, wordt het FMR gefosforyleerd (figuur 6a). De translatierepressie valt hierdoor weg. De mRNA’s worden nu dus direct afgeschreven aan de uiteinden van de dendrieten. Er kan hierdoor dus een zeer snelle respons ontstaan die uitsluitend afhankelijk is van translatiesnelheid en dus niet ook nog van transportsnelheid van de eiwitten over de microtubuli. De receptor die het signaal van de axonen ontvangt is ook een target-mRNA voor FRMP.

Figuur 6: a. Normale respons in de dendritische uiteinden: translatierepressie valt weg na stimulatie van de dendriet, waardoor de nieuwe eiwitten snel gemaakt kunnen worden. b. Stimulatie van dendrieten in FXS-patiënten: er is geen FMRP aanwezig, waardoor de snelle schakeling niet plaats kan vinden. Het signaal blijft te lang aan- ofwel uitstaan (Long Term Depression).

FMRP-functie in context: mentale retardatie in FXS-patiënten

Bij FXS-patiënten is het FMRP geheel afwezig, waardoor de hierboven beschreven snelle respons in de dendritische uiteinden niet mogelijk is (figuur 6b). Hierdoor kan de response lange tijd uitblijven (‘LTD: Long Term Depression of synaptic transmission’) of juist langere tijd aan blijven staan. De snelle responses die door FMRP bemiddeld worden, zijn echter essentieel voor de plasticiteit van de hersenen. Bij FXS-patiënten is de plasticiteit van de hersen daardoor zeer veel lager dan bij gezonde mensen, wat mogelijk de mentale retardatie in deze patiënten kan verklaren.

Fragile X Syndrome Colin Stok, Oktober 2013

Molecular Defects in Human Diseases, Docent: J. Brouwer

FMRP-functie in context: premutaties in het FMR1-gen

Er zijn een aantal diseased fenotypen die sterk gerelateerd zijn aan FXS. Deze ziekten komen voor bij mensen die de premutatie (50-200 repeats) hebben. Twee voorbeelden;

FXPOI: ‘Fragile X related primary ovarian in-sufficiency’. 20% van de vrouwen met de premutatie lijdt aan deze ziekte die vroege overgang als symptoom heeft

FXTAS: ‘Fragile X related tremor/ataxia syndrome’. 50% van de vrouwen met de premutatie van meer dan 70 repeats lijdt hieraan. Het is een neurodegeneratieve ziekte.

De precieze oorzaak van deze ziektes is niet bekend. Opvallend is wel dat bij mensen die de premutatie hebben, juist sterke upregulatie is van het FMR1-gen (figuur 7). Door deze hoge expressieniveaus, vindt mogelijk aggregatie plaats van de RNA-FMRP-complexen, waardoor een groot deel van het FMRP als nog zijn functie verliest doordat het wordt weggevangen in de aggregaten. Mogelijk is verlies van FMRP-activiteit aanleiding tot ziekten als FXPOI en FXTAS.

dooierzak, wordt ook de darm afgesnoerd. De allantois is de oerblaas. De dooierzak is continu met het endoderm van het embryo. Alleen ter hoogte van de navelstreng zou je nog een beetje endoderm zien van de dooierzak. In de vierde week zie je al wat knopjes, waaruit de orgaansystemen gaan ontstaan.

Het endoderm bestaat uit verschillende onderdelen, namelijk uit:

- de voordarm: keel, slokdarm, long, maag, (bij)schildklier, lever, alvleesklier, twaalf vingerige darm;

- de middendarm: grootste deel van dunne darm en deel van dikke darm; verbonden met dooierzak tijdens ontwikkeling;

- de einddarm: dikke darm, rectum, blaas, urethra.

De cloaca is eigenlijk een samenvoeging van de verschillende onderdelen van de einddarm. Het hart wordt uit het mesoderm gevormd.

Fysiologische navelbreuk = darmen zijn te groot om in de buikholte te ontwikkelen, dus deze structuren ontwikkelen zich tijdelijk daarbuiten. Dit begint ongeveer vanaf 6 tot 8 weken en duurt tot het midden van de 11e week (het proces moet uiterlijk bij 7 weken beginnen). Differentiatie van het mesoderm (deel 2): het paraxiale mesoderm en de ledemaatknoppen Gisteren hebben we naar het axiale component gekeken: de chorda dorsalis. Uit het paraxiale mesoderm worden somieten gevormd en daaruit worden vervolgens wervels, huid en spieren gevormd. Uit het intermediaire mesoderm ontstaat het urogenitaalsysteem en uit het laterale mesoderm ontstaan de lichaamsholte bekleding en het vasculaire systeem. Stuvia.com - De Marktplaats voor het Kopen en Verkopen van je Studiemateriaal

Je kunt wervels onderverdelen in caudale (3-5), sacrale, lumbale (5), thoracale (12) (dragen de ribben) en cervicale (7) wervels. Van craniaal naar caudaal zie je dat somieten worden afgesnoerd. Wanneer somieten nog gevormd moeten worden noem je dit presomitisch mesoderm. De somieten zorgen voor de organisatie van het

segmentale patroon. Je hebt twee typen: somitomeren (craniale gedeelte) en somieten. Ze worden gevormd uit het presomitisch mesoderm van craniaal naar caudaal, net zoals de meeste andere processen. De vorming van somieten wordt heel streng gereguleerd middels een moleculaire klok: Notch, FGF8 en WNt3a. Dus de somitomeren dragen bij aan de vorming van de schedel en de somieten aan de vorming van de wervels, ribben, huid (rug) en de skeletspieren (rug, lichaamswand en ledematen). Een mens heeft 44 somietparen. Iedere keer als de expressie van “klok”genen op een top is krijg je een nieuw paar somieten. Bij langere gewervelden zie je eenzelfde sinus, maar dit gaat veel sneller. Je kunt het aantal somieten gebruiken om te bepalen hoe oud een embryo is. Bij de mens worden de somieten aangelegd tussen dag 20 en dag 35 (= somitogenese). Bij de mens wordt in 6 uur ongeveer 1 somietpaar gevormd.

Wat gebeurt er met de somieten? Hoe gaat dat ook alweer? Als je iets later in de ontwikkeling kijkt zie je dat de somiet uiteen gaat vallen in verschillende structuren: sclerotoom (harde onderdelen, bot/wervels), dermomyotoom (huid- en spieronderdelen). Er is nu ook sprake van EMT, zodat de cellen mooi om de neurale buis kunnen migreren om de wervels te vormen. Sclerotoom: SSH en noggin zorgen ervoor dat inductie van het maken van ribben en de wervelkolom plaatsvindt. Dermatoom: bij het maken van huid en onderhuids bindweefsel speelt Neurotrophin-3 een belangrijke rol en bij het maken van de rugspieren en de spieren van de ledematen (= myotoom) speelt WNT een belangrijke rol.

De myoblasten gaan naar de ledemaatknoppen en deze gaan skeletspieren vormen, het myotoom gaat de rugspieren vormen, de sclerotoom de skeletstructuren en de dermotoom het onderhuidse bindweefsel.

Welke somiet wordt een halswervel, welke een lendewervel? Het gaat hier om de specificatie van de anterior (craniaal)- posterior (caudaal) as. Hoe wordt dit aangestuurd? Dit gebeurt al heel vroeg in de ontwikkeling, al voordat de somiet echt is aangemaakt (dus al voor de somitogenese) wordt dit bepaald, dus al in het presomitisch mesoderm. De homeobox (hox) eiwitten reguleren deze specificatie, en spelen dus een hele belangrijke rol. Ze beïnvloeden de expressie van genen, het zijn dus specifieke transcriptiefactoren. Deze genen zijn evolutionair geconserveerd. Ze zijn altijd aanwezig geweest om de specificatie van de as te reguleren. Ze heten allemaal wat anders, maar het zijn allemaal homologe eiwitten van elkaar. Ze liggen op een rijtje, van maximaal 13 genen, op het chromosoom. Je hebt 4 clusters op 4 chromosomen bij zoogdieren (A, B, C, D = paralogen). De genen worden na elkaar aangezet waarbij de laatst aangeschakelde de voorgaande afremt. De genen staan eerst aan in het hoofdgebied (3’ zijde) en langzamerhand meer caudaal (5’ zijde). Ze zijn gevoelig voor vitamine A (wat wordt geporduceerd in het staartgebied), caudale Hox genen zijn het minst gevoelig voor vitamine A. Als je vier genen hebt, kun je verschillende weefsels krijgen bij verschillende combinaties van de genen. Dus dit beïnvloedt weefselspecificatie, ze zullen elkaar steeds overlappen. Hoe verder je kijkt op de as, dus meer naar caudaal, hoe hoger het nummer van het gen dat aanstaat. Het hoogste hox nummer is eigenlijk het meest bepalend dit noem je het posteriore prevalentie concept (= posteriore Hox genen zijn dominant in functie t.o.v. anteriore Hox genen in overlappende expressie gebieden).

Bijvoorbeeld bij de ribvorming remt hoxa10 hoxb6, zo wordt bepaald dat de lumbale wervels geen ribben krijgen. Bij Hoxb6 overexpressie krijg je te veel ribben, dus ook lumbaal, hoxa10 kan het dan niet onderdrukken. En bij een te veel aan Hoxa10 krijg je juist helemaal geen ribben in het embryo.

Je kunt de ap-as op twee manieren veranderen: je kunt posteriorizeren (te veel aan vitamine A of te veel Hox genen, dus overexpressie, je krijgt dan een extra wervel met een rib dus wanneer je nog in de cervicale zone zit) en anteriorizeren (bij mutaties in RAR, dan wordt het vitamine A signaal niet doorgegeven of bij hox mutanten). Kleine transformaties worden meestal gedoogd door het lichaam.

De hoxgenen zijn ook betrokken bij het positioneren van de ledemaatknoppen. Armknoppen ontstaan anterior van Hox6 en beenknopen ontstaan posterior van Hox8. Hoe ontstaan deze knopjes? Deze worden gemaakt uit twee typen mesoderm: uit het paraxiale mesoderm (myotoom zorgt voor de ledemaatspieren) en uit het laterale mesoderm (zorgt voor de ledemaatbotten). Er is sprake van een continue interactie tussen paracriene factoren tijdens de vorming van ledematen. De eerste stap is dat uit het intermediare mesoderm FGF8 wordt afgegeven en deze induceert Fgf10. FGF10 induceert vervolgens in het laterale plaat mesoderm weer Fgf8 in het ectoderm. Fgf8 en 10 houden elkaar dus in stand en zorgen voor de proliferatie van de knop. Vervolgens induceert Fgf8 uit het ectoderm Shh in het laterale plaat mesoderm. Shh induceert dan Fgf4 in het ectoderm.

De FGFs behouden dus de cel proliferatie en de shh expressie. Op deze manier heb je constante proliferatie (in de AER) en specificatie (in de ZPA) van de ledemaatknop. De AER (apical ectodermal ridge) is nodig voor de proliferatie van de ledemaatknop, daarnaast worden er moleculen die de anterior posterior as specificeren tot expressie gebracht. Verder vindt er interactie plaats met eiwitten die de A-P as en de D-V as specificeren. Anterior is de duimzijde en het dorsale deel is de bovenkant.

De ZPA (zone of polarizing activity) zorgt met name voor specificatie. Shh remt duimvorming, dus de shh gradiënt neemt af naar de anteriore zijde.

Vorming van het centrale zenuwstelsel

De neurale buis, die gevormd wordt in de 4e ontwikkelingsweek, is de voorloper van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg). De neurale buis ontstaat uit het ectoderm. Het ectoderm bestaat uit epiblast cellen die niet door de primitief streep zijn gemigreerd tijdens de gastrulatie. Hoe ontstaat ook alweer het neurale ectoderm? De chorda dorsalis speelt hierbij een belangrijke rol. Deze zorgt voor de inductie van de neurale plaat door het afgeven van SSH, FGF, noggin, chordin en follistatin (deze laatste drie voor remming van BMP-4, en remmen dus huidvorming). De neurale plaat zal uiteindelijk gaan omvormen tot de neurale goot, aan weerszijde zie je de neurale zijden/wallen, deze fuseren uiteindelijke aan de dorsale zijde waardoor de neurale buis ontstaat. De chorda dorsalis induceert de neurale plaat van craniaal naar caudaal, over de gehele lichaamsas. Dit heeft te maken met de aanleg van de chorda zelf, deze is ook van craniaal naar caudaal. Alleen bij een hoge concentratie van shh, noggin, chordin, follistatin, fgf en Wnt3a krijg je inductie van neuraal weefsel.

Er zijn twee typen krachten die zorgen voor de neurale buis sluiting: intrinsiek (neurale plaat, dus de cellen zelf die van vorm veranderen) en extrinsiek (somieten en non-neuronaal ectoderm). De somieten geven een stuwende kracht aan de neurale plaat. De sluiting begint altijd bij de cervicale zone (ongeveer in het midden), daarna gaat deze verder in anteriore en posteriore richting. Je hebt verder nog een derde sluitingspunt (beide uiteinden boven en onder). Dit gebeurt allemaal in de 4e week. Bij de sluiting van de neurale buis, ontstaan de neurale lijst cellen, deze laten los van de neurale dakplaat. Ook dit is een EMT proces. Uit het neurale epitheel laten wat cellen los die daarna door het hele lichaam gaan migreren. Er zijn heel veel neurale lijst afkomstige cellen: melanocyten, bindweefsel en botten van gezicht en schedel, huid van gezicht en nek, hersenvliezen, craniale en spinale zenuwknopen (ganglia), bijniermerg, glia cellen (non-neuronale steuncellen). Wanneer de neurale buis niet goed sluit, ontstaan neurale buis defecten (NBD). Je hebt twee soorten: craniaal (anencefalie) en caudaal (spina bifida).

Neurale buis defecten komen bij 1 op de 1000 neonaten voor. Zowel genetische als omgevingsfactoren spelen hierbij een rol. Het kan ook nog helemaal verkeerd gaan dit heet: craniorachischisis. Uit de neurale buis ontstaan onder andere de hersenen. Embryonale hersenstructuren zijn: het prosencephalon (later het telencephalon en het diencephalon), het mesencephalon en het rhombencephalon (later het metencephalon en het mylencephalon). Ook hierbij kunnen dingen fout gaan, een voorbeeld hiervan is holoprosenphalie, hierbij zijn de voorhersenen niet gesplitst in cerebrale hemisferen (er is sprake van een stoornis in de ventrale inductie).

Genen, eiwitten en cel differentiatie

Hoe wordt een embryo gemaakt? Iedere cel van een embryo heeft dezelfde genetische informatie, maar toch worden ze allemaal iets anders. Deze verschillen tussen cellen ontstaan door prikkels tussen en in deze cellen. Deze signalen veranderen de activiteit van de genen. De actieve genen bepalen welke eiwitten in een cel worden aangemaakt. De eiwitten bepalen de vorm en de eigenschappen van de cel.

Dit laatste heet cel specificatie, dit kan zowel autonoom (asymmetrische celdeling) zijn als niet-autonoom (inductie door een andere cel). Er zijn verschillende niveaus waarop je kunt ingrijpen voor genexpressie. Dit leidt tot heel veel verschillende soorten eiwitten die wel/niet tot expressie komen. De 4 niveaus zijn: transcriptie, wel/geen RNA processing, wel/geen mRNA translatie, wel/geen eiwitmodificatie? Enhancers en silencers selectedren en remmen de basale transcriptiefactoren d.m.v. specifieke transcriptiefactoren. Gaande weg de ontwikkeling van een embryo krijg je verschillende cellen. Twee hele belangrijke transciptiefactoren hierbij zijn: eiwit A = Cdx2 (voor trofectoderm) en eiwit B = Oct3/4 (voor inner cell mass). Deze eiwitten fluctueren heel erg, tot opeens het nette patroon verdwijnt, daarna krijg je stabilisatie van a of b expressie. Dit verschilt per cel en zo wordt bepaald wie wat wordt.

Dit is een van de eerste specificaties binnen een embryo. Waarschijnlijk is dit autonoom, maar dat is nog niet zeker. Een niet autonome specificatie wordt uitgevoerd d.m.v. morfogenen (bijvoorbeeld retinoine zuur). Zij bepalen de morfologie van een cel door het gedrag van de cel. Dit werkt door de positie van de cel en de gradiënten die door deze positie lopen. Op alle assen krijgt de cel dan informatie zodat ie weet wat ie moet worden. Het heeft dus te maken met de concentratie van een morfogen, hoe een cel zich gaat ontwikkelen. Daarnaast spelen drempelwaarden een rol.

Samenvatting

• Het endoderm ontwikkelt zich tot darm en daarvan afgeleide structuren.

• Het paraxiale mesoderm ontwikkelt zich tot somieten, de oersegmenten van het lichaam.

• Somieten ontwikkelen zich tot huid, wervels en spieren.

• Ledematen ontstaan uit paraxiaal en lateraal mesoderm en differentieren o.i.v. twee signaleringscentra, de AER en de ZPA.

• De chorda dorsalis induceert de vorming van de neurale buis en daarmee het centrale zenuwstelsel.

• De neurale lijst groeit weg van het dak van de neurale buis en vormt het perifere zenuwstelsel en andere cellen.

• Neurale buis defecten ontstaan vroeg tijdens de zwangerschap en worden veroorzaakt door genetische en omgevingsfactoren.

• Differentiële genexpressie t.g.v. autonome of niet autonome signalen leidt tot specificatie en vervolgens differentiatie van cellen.